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Il DNA è la sigla dell'acido desossiribonucleico (Desoxyribose Nucleic Acid), composto chimico macromolecolare appartenente al gruppo degli acidi nucleici. È contenuto nel nucleo delle cellule dove svolge la funzione di portatore dell'informazione genetica.

La biologia moderna ha avuto origine con la scoperta della struttura a doppia elica del DNA e questa struttura suggerisce molti aspetti delle sue importanti funzioni. Il DNA è formato da due catene polinucleotidiche (i nucleotidi sono i singoli componenti della catena) che si avvitano una sull'altra con una struttura a elica. Lo scheletro esterno è costituito da una catena ripetuta zucchero-fosfato e la parte codificante, costituita dalle basi adenina (A), citosina (C), guanina (G) e timina (T) si trova all'interno. Le basi si appaiano tra loro con una regola precisa, adenina con timina e guanina con citosina. La forma delle basi è molto piatta e sono disposte in maniera parallela tra loro, come i gradini di una scala a chiocciola. Le due eliche sono tenute insieme attraverso interazioni deboli che si chiamano "legami idrogeno", costituiti tra le estremità di ciascuna base. A e T formano due legami idrogeno, G e C tre legami, che rendono questo appaiamento più stabile. In un DNA con un grosso contenuto di G e C le due eliche si separeranno più difficilmente che in un DNA con molte A e T. Il diametro di una molecola è ca. 2,5 nm e la distanza tra due basi è di ca. 0,34 nm e l'elica forma un giro completo ogni 3.4 nm, quindi ci sono ca. 10 basi per ogni giro di elica. Esistono varie strutture del DNA che si definiscono come A, B e Z. La A è la meno frequente e rappresenta il DNA quando non è in soluzione, è più compatta e contiene 11 basi per giro. La B è la più frequente ed è quella a cui ci si riferisce in generale, rappresenta il DNA in una soluzione acquosa e forma al suo esterno due solchi di diverse dimensioni chiamati solco maggiore e solco minore. Queste regioni sono le zone dove avviene il riconoscimento da parte di varie proteine ed enzimi delle sequenze specifiche del DNA e rappresentano le zone dove il DNA viene "letto". Oltre alla forma B dall'elica destrorsa, ne esiste una terza denominata Z con un'elica sinistrorsa. Questa struttura si può formare in brevi tratti costituiti da una alternanza delle basi G e C ripetute varie volte. Si pensa che possa avere delle funzioni strutturali e di informazione in alcuni processi cellulari e inoltre una sua eccessiva presenza può causare malattie autoimmuni. Nonostante la moltitudine dei legami formati dall'appaiamento delle basi renda il DNA una molecola piuttosto stabile, tuttavia essa è libera di muoversi e flettersi lungo il suo asse maggiore e questa flessibilità le permette di piegarsi e modellarsi attorno a strutture proteiche. Inoltre in alcune sequenze, a causa del particolare ingombro nello spazio delle basi e dell'influenza che ciascuna di esse ha sulla base adiacente, il DNA presenta una conformazione naturalmente piegata. Questo tipo di struttura è particolarmente importante nella formazione della fibra di cromatina, costituita da DNA e istoni, e in quella di complessi proteici che regolano la trascrizione dell'RNA. Le due catene del DNA si possono separare e in questa maniera la molecola si denatura. La separazione avviene in molti processi biologici, in particolare durante la replicazione e la trascrizione. La denaturazione del DNA può essere indotta chimicamente o con il calore e questa metodologia è molto utile per analizzare varie funzioni di questa molecola. Generalmente il DNA di tutti i Batteri e quello di molti virus ha una struttura circolare e anche nel caso di organismi superiori, compreso l'uomo, il DNA cromosomico è costituito da varie anse di DNA circolare ancorate a strutture proteiche. Il suo comportamento nello spazio quindi è molto simile a quello del DNA circolare e gli permette di assumere diverse conformazioni nello spazio che vengono definite come "topoisomeri" (dal greco topos = spazio). Nella cellula esistono degli enzimi che regolano queste strutture e si chiamano DNA-topoisomerasi. I parametri topologici del DNA vengono definiti in base alle regole matematiche della topologia e sono: L, il "numero di legame", che rappresenta il numero di volte che un'elica passa intorno all'altra, in un DNA di lunghezza definita; poiché ogni giro di elica è costituito da dieci basi, il numero di legame di una molecola lunga 1000 basi, sarà 100. W, "writhe" che rappresenta il numero di volte che il DNA è annodato su se stesso nello spazio, e T, "twist", che rappresenta il passo dell'elica. Queste grandezze sono collegate tra loro dall'equazione L= T+W. Se il DNA viene srotolato e quindi il suo T diminuisce, di conseguenza aumenterà il W, vale a dire la molecola assumerà una conformazione super avvolta. Il DNA, in natura, ha nella maggior parte dei casi una struttura superavvolta.

DNA-TOPOISOMERASI

Il DNA non è una struttura statica, ma è libera di muoversi nello spazio fluido della cellula, assumendo varie conformazioni topologiche, come annodarsi e avvolgersi su se stesso. Inoltre tutti i processi cellulari che comportano uno scorrimento di complessi proteici sul DNA alterano la sua struttura nello spazio, torcendolo, srotolandolo e creando delle regioni di superavvolgimento del tutto simili a quelle che può assumere una corda o un elastico. Questa struttura del DNA nello spazio viene controllata e regolata da una serie di enzimi che si chiamano DNA- topoisomerasi. Esistono due classi di questi enzimi, definite in base al loro meccanismo d'azione. Gli enzimi di classe I sono costituiti generalmente da un monomero e sono capaci di introdurre una rottura su un singolo filamento della doppia elica del DNA, rilassando il DNA di un giro alla volta. La reazione non richiede un apporto di energia sotto forma di ATP. Gli enzimi di classe II sono costituiti da due o più subunità e sono capaci di introdurre tagli su entrambi i filamenti della doppia elica del DNA per srotolarlo. In questo caso la reazione procede solo in presenza di ATP. Ogni reazione di topoisomerizzazione, sia essa dovuta a enzimi di classe I o classe II, può essere divisa in tre momenti. Il primo consiste nella rottura del filamento, o dei filamenti, e nella formazione di un legame covalente tra l'enzima e il DNA. Il secondo consiste nel passaggio del filamento, o dei filamenti, intatti attraverso il sito di rottura. Nel terzo e ultimo momento avviene la saldatura covalente dei filamenti precedentemente tagliati. L'energia necessaria a ricostituire la catena polinucleotidica intatta è conservata nel legame tra l'enzima e il filamento interrotto e negli enzimi di tipo II, che richiedono ATP come fattore energetico, questa molecola viene usata come induttore di grossi cambi conformazionali. Negli ultimi anni la ricerca sulle topoisomerasi ha avuto un enorme sviluppo grazie a studi di cristallografia che hanno contribuito in maniera essenziale alla verifica dei modelli proposti per il loro meccanismo di azione. Tuttavia è stata individuata la struttura cristallografica solo di alcuni frammenti proteici di questi enzimi e probabilmente questo è dovuto alla loro complessità e flessibilità che rende difficile la cristallizzazione dell'enzima intero. Nel caso della topoisomerasi II di lievito, il frammento cristallizzato rappresenta la parte che contiene il sito attivo che assume una forma a tenaglia. Questo enzima infatti funziona come una vera e propria tenaglia che intrappola il DNA al suo interno aprendosi nella parte superiore, poi permette il passaggio di un'altra regione di DNA a doppio filamento nell'apertura prodotta. Alla fine della reazione la parte inferiore dell'enzima si apre come un cancello e il filamento trasportato attraverso la tenaglia può uscire. Questa serie complessa di reazioni viene provocata da cambi conformazionali dovuti alla molecola di ATP che si lega nella parte N terminale dell'enzima. Le DNA-topoisomerasi hanno assunto un'importanza primaria nella ricerca oncologica perché molti farmaci antitumorali hanno come target specifico questi enzimi, e quindi lo sviluppo di farmaci più efficienti, che superino la farmaco-resistenza, è uno degli obiettivi primari della ricerca di nuovi farmaci antitumorali.

RNA

L’RNA è la sigla dell'acido ribonucleico (Ribonucleic Acid), come il DNA, anche l’RNA è una molecola polinucleotidica, in quanto è formata dall’unione di numerosissime unità semplici, i nucleotidi. Ogni nucleotide è a sua volta formato da una base azotata, da un pentoso e da un radicale fosforico. Mentre nel DNA il pentoso è il desossiribosio, nell’RNA è il ribosio. Le basi azotate sono uguali a quelle del DNA, fatta eccezione per la timina, che nell’RNA è sostituita dall’uracile. Mentre il DNA è una molecola di grandi dimensioni e notevolmente stabile, gli RNA sono più piccoli, hanno vita limitata e inoltre sono caratterizzati da una struttura primaria a singolo filamento: il fatto che basi azotate fra loro complementari (A e U; C e G) possano ritrovarsi periodicamente in sequenza lungo lo scheletro della molecola e appaiarsi ne rende possibile il ripiegamento e la conseguente formazione di zone a struttura secondaria elicoidale; piccole molecole di RNA sono quindi in grado di acquisire una struttura tridimensionale regolare, spesso responsabile della loro funzione specifica, mentre RNA più grandi presentano zone a struttura tridimensionale definita congiunte fra loro da parti non strutturate. La forma funzionale di un RNA spesso non è della stessa lunghezza del trascritto primario inattivo o incompleto: il passaggio dalla forma primaria inattiva a quella finale funzionale avviene ad opera di enzimi specifici che rimuovono alcune zone della molecola o apportano modifiche chimiche. I principali tipi di RNA sono l’RNA messaggero (mRNA), sul quale il DNA trascrive i codoni di una proteina, l’RNA di trasporto (tRNA), che viene utilizzato per il trasporto degli amminoacidi da assemblare in proteine e l’RNA ribosomale (rRNA) che forma con proteine specifiche i ribosomi, organelli sui quali avviene la sintesi proteica. Questi tre tipi di RNA sono elementi chiave per la decodificazione del messaggio genetico e la formazione delle proteine. L’mRNA rappresenta la classe di RNA più eterogenea; infatti è costituita da filamenti contenenti tanti codoni quanti sono gli amminoacidi delle proteine da loro codificate. RNA messaggeri codificanti per piccole proteine sono costituiti da alcune centinaia di nucleotidi, quelli codificanti per proteine grandi ne comprendono varie migliaia. Ogni mRNA è caratterizzato dal codone d’inizio AUG, specifico per l’amminoacido metionina: tutte le catene proteiche sia delle cellule procariote che di quelle eucariote cominciano con questo amminoacido. I tre codoni UAA, UGA e UAG rappresentano invece il segnale di terminazione della sintesi della catena polipeptidica. La precisione nell’andamento lineare dei ribonucleotidi in gruppi di tre, non solo determina il corretto allineamento degli amminoacidi in una proteina, ma anche un esatto punto di inizio e di conclusione della sua sintesi. Nei procarioti un singolo mRNA può contenere l’informazione per più di una proteina. Negli eucarioti la trascrizione genera dei precursori nucleari degli mRNA (trascritti primari) caratterizzati dalla presenza di modificazioni chimiche all’estremità 5' (si definisce estremità 5' l’inizio della molecola, mentre l’estremità finale è denominata estremità 3') e dalla presenza di zone non codificanti (introni). Tali precursori vengono in seguito convertiti negli mRNA maturi attraverso un processo (splicing) che prevede la rimozione degli introni e il ricongiungimento delle parti codificanti (esoni); lo splicing avviene grazie a un apparato enzimatico complesso in grado di riconoscere sequenze specifiche presenti nelle zone di giunzione esone-introne, di rimuovere gli introni e di ricongiungere correttamente tra loro i vari esoni. I complessi RNA-proteine che si formano durante questo processo sono detti spliceosomi. È stato stimato che circa un centinaio di proteine siano coinvolte nello splicing, rendendo tale processo comparabile per complessità e importanza a quello che avviene all’inizio della trascrizione o nella sintesi proteica. A volte la rimozione degli introni e il ricongiungimento degli esoni può avvenire secondo piani alternativi, consentendo così la formazione di varianti proteiche a partire da uno stesso gene; questo meccanismo, detto splicing alternativo, è responsabile, p. es., della grande variabilità all’interno delle varie classi di anticorpi. La maturazione all’estremità 3' del trascritto primario implica un taglio attuato da una endonucleasi e la successiva aggiunta di una serie di adenine (poliadenilazione) dovuta all’enzima poly-A polimerasi. L’mRNA maturo diventa così funzionale e, rimanendo associato a proteine, può venire trasportato attraverso i pori nucleari dal nucleo al citoplasma. Qui si dissocia dalle proteine nucleari e si lega a proteine citoplasmatiche: alcune sono in grado di riconoscere la zona di poliadenilazione, mentre altre sono responsabili della successiva localizzazione degli mRNA nei vari distretti citoplasmatici. La quantità di mRNA all’interno di una cellula è una funzione sia della sua velocità di sintesi sia della velocità con cui viene degradato; nei procarioti generalmente queste molecole hanno vita breve e vengono degradate in pochi minuti; negli eucarioti, invece, gli mRNA sono più stabili: vivono da qualche decina di ore a vari giorni. Tuttavia alcune proteine, quali p. es., le linfochine, possono essere necessarie solo in un determinato momento e per poco tempo, e di conseguenza anche i loro mRNA hanno vita molto breve. n Il tRNA trasferisce ai ribosomi i vari amminoacidi che, uniti tra loro con legame peptidico, formano le proteine. Molti trascritti primari che originano dai geni per i tRNA sono discretamente più lunghi rispetto alle piccole molecole mature che si riversano nel citoplasma e che contengono molte basi modificate, anche queste ultime assenti nella molecola iniziale. Sono stati clonati e sequenziati molti geni codificanti per i tRNA, e il confronto fra tali sequenze e quelle dei tRNA ha messo in evidenza, anche in questo caso, la presenza di introni. Tali introni, la cui lunghezza varia tra i 14 e i 60 ribonucleotidi, sono più corti rispetto a quelli presenti nei precursori degli mRNA, e non contengono sequenze specifiche per la determinazione dei siti di splicing, sebbene tali zone occupino sempre la stessa posizione relativa all’interno della molecola precursore. Tali introni vengono rimossi e gli esoni riassemblati attraverso un processo enzimatico diverso da quello responsabile della maturazione degli mRNA e che prevede l’intervento di un enzima ad attività endonucleasica e di una RNA-ligasi ATP-dipendente. I precursori dei tRNA contengono inoltre all’estremità 5' una sequenza di lunghezza variabile, assente nel tRNA maturo. Tali nucleotidi vengono rimossi dall’enzima RNasi P. Recentemente è stata messa in evidenza una particolare classe di introni, presenti nei precursori di tRNA di cloroplasti e mitocondri di piante e funghi, che sono in grado di autoescludersi dalla molecola senza la partecipazione di altri enzimi (introni self-splicing): questi RNA possono svolgere funzione di catalizzatori nelle reazioni chimiche che prevedono la rottura di legami covalenti. È stato dimostrato che, mentre i precursori risiedono solo nel nucleo, i tRNA maturi sono presenti solo nel citoplasma: come tutte le macromolecole trasportate dal nucleo al citoplasma, anche i tRNA maturi vengono trasportati attraverso i pori nucleari, probabilmente associati a proteine specifiche che ne facilitano il passaggio. Una volta giunti nel citoplasma, i tRNA maturi si presentano come molecole piccole, costituite da 75-80 nucleotidi che si appaiano tra loro in zone specifiche, interrotte da tratti a singolo filamento. Tale situazione determina una particolare conformazione a “trifoglio”, caratteristica per tutti i tRNA. Nella cellula, tuttavia, questa molecola ha una complessa organizzazione a forma di L rovesciata e contorta a spirale, poiché le due anse laterali del trifoglio si avvicinano tra loro formando l’angolo fra i bracci della L. L’estremità 3' del filamento polinucleotidico di tutti i tRNA sopravanza quella 5' di tre nucleotidi uguali (C-C-A): tale sequenza rappresenta il sito accettore dell’amminoacido che, una volta attivato dall’enzima amminoacilsintetasi, si posiziona sul tRNA. Sotto al sito accettore c’è un breve tratto a elica, quindi le due anse che interagiscono tra loro nella struttura tridimensionale: una è detta ansa T ed è la parte della molecola che riconosce i siti A e P del ribosoma; l’altra è detta ansa D e costituisce la parte del tRNA riconosciuta dalle varie amminoacilsintetasi quando queste attivano i rispettivi amminoacidi. In base alla forma dell’ansa D e del braccio a doppia elica a essa collegato, si distinguono circa venti tRNA, ciascuno specifico per un determinato amminoacido. La parte più caratteristica della molecola del tRNA è l’ansa terminale; è detta anticodone poiché porta tre basi complementari ai codoni degli mRNA. In base all’analisi di tali sequenze si distinguono circa sessanta diversi tRNA; solo pochi di essi non trasportano amminoacidi in quanto i loro anticodoni corrispondono alle triplette d’inizio o di terminazione della sintesi proteica. n Gli rRNA costituiscono una famiglia di molecole che, assemblate insieme a più di 50 diverse proteine, formano i ribosomi, costituiti da due subunità; le subunità proteiche e le molecole di rRNA a esse associate vengono definite in termini di Svedberg (S), una misura del coefficiente di sedimentazione di particelle in sospensione sottoposte a centrifugazione. La lunghezza delle molecole di rRNA, la qualità delle proteine costituenti ciascuna subunità e di conseguenza la grandezza di queste ultime varia tra procarioti ed eucarioti. Sebbene la sequenza di ciascun rRNA vari tra specie diverse, le zone corrispondenti di ciascun tipo di rRNA possono appaiarsi nelle medesime posizioni, rendendo tutte le molecole simili per struttura secondaria. Appare quindi evidente che le interazioni rRNA-proteine ribosomali siano conservate all’interno della scala evolutiva. In base ai loro coefficienti di sedimentazione, i ribosomi sono stati suddivisi in due classi: la prima, di 70 S, è formata da una subunità di 30 S e da una di 50 S; questi ribosomi sono tipici dei procarioti. La seconda classe è quella dei ribosomi 80 S, con subunità di 40 S e di 60 S; si ritrovano nel citoplasma delle cellule eucariotiche. Nei mitocondri e nei cloroplasti si ritrovano ribosomi che spesso somigliano a quelli dei procarioti. Nei ribosomi procariotici l’RNA corrisponde a circa il 70% del loro peso, mentre in quelli eucariotici ne rappresenta circa il 50%. Nei ribosomi 70 S ci sono tre molecole di RNA: una, a 16 S, nella subunità 30 S; due, rispettivamente di 23 S e di 5 S, nella subunità 50 S. Nei ribosomi 80 S ci sono quattro molecole di RNA: una, di 18 S, nella subunità minore; tre, rispettivamente di 28 S, 5,8 S e 5 S, nella subunità maggiore; si ritiene che l’rRNA a 5,8 S corrisponda a quello 5 S dei ribosomi procariotici: esso infatti viene sintetizzato da geni diversi da quelli che producono gli altri RNA ribosomali che rappresentano i prodotti di maturazione di una singola molecola precursore. La semplice interazione fra proteine ribosomali e rRNA è sufficiente per la costituzione delle subunità ribosomali (self-assembling), e si ritiene che la capacità di costituirsi spontaneamente sia alla base del processo di formazione del ribosoma. Negli eucarioti i geni che codificano per gli rRNA sono localizzati nel nucleolo, che si evidenzia come un corpicciolo sferico situato nel nucleo. Tale conformazione è dovuta all’intensa attività trascrizionale che si attua al livello di questi geni, e dal quasi contemporaneo assemblaggio degli RNA alle proteine ribosomali o alle proteine deputate alla maturazione dei precursori degli RNA. La trascrizione è caratterizzata dal fatto che più molecole di RNA-polimerasi I, l’enzima deputato alla formazione di questi RNA, possono operare in serie successiva sul medesimo gene per aumentarne la quantità di prodotto. I precursori nascenti vengono immediatamente processati negli rRNA 18 S, 5,8 S e 28 S, mentre l’rRNA 5 S viene codificato da un gene distinto che non si trova nel nucleolo Tutte le specie sono provviste di oltre 100 copie di geni codificanti per il precursore degli rRNA e per l’rRNA 5 S. Il processo di maturazione del precursore unico per tre rRNA avviene grazie all’azione di altri piccoli RNA ad attività catalitica, che agiscono in concerto con proteine specifiche nel riconoscimento di sequenze segnale per la determinazione del sito di splicing; la maturazione degli RNA ribosomali prevede anche modificazioni chimiche, quali l’aggiunta di gruppi metilici in basi specifiche. In alcuni organismi unicellulari, nei mitocondri e nei cloroplasti è stato possibile evidenziare la capacità dei precursori degli rRNA di rimuovere autonomamente le parti non necessarie, senza la partecipazione di enzimi specifici (self-splicing). Appare evidente che in questo caso l’RNA si comporta come un vero e proprio enzima (ribozima), cioè come sequenza di RNA con attività catalitica. L’rRNA 5 S invece, una volta trascritto migra verso il nucleolo, dove si assembla con gli altri rRNA e con le proteine ribosomali costituendo così i ribosomi; tali organelli passano quindi nel citoplasma. Gli RNA catalitici sono stati isolati in vari sistemi e rappresentano una classe di molecole biologiche molto importanti (“mondo a RNA”) che possono aver avuto un ruolo fondamentale nell’origine della vita sul pianeta.